BD FACS Aria III分选小结
BD FACS Aria III分选小结建议在师兄师姐的指导下进行首次实验。
如何正确使用BD FACS Aria III?
等高线图是具有相同事件频率的点合集
最初级的图是单参数直方图。即荧光强度-细胞数图。其次是双参数散点图，每个点代表一个细胞。等高线图，所谓的同一线本身并不直接表示具体的细胞数量，而是表示在某一特定参数组合下，检测到的细胞数量相同，即具有相同事件频率的点合集。在同一条等高线上的所有点，都代表了一群具有相同参数（例如FSC和SSC或者荧光强度）的细胞。等高线的圈嵌套，这主要是为了更好地表示数据的分布情况。如果两个参数（例如FSC和SSC或者两种荧光染料的强度）之间存在强相关性，那么等高线图中就可能会出现圈的嵌套。而如果两个参数之间的相关性较弱，那么等高线图中就可能会出现独立的两个圈，这代表了两种不同的细胞群体。
Drop Delay是分析和采集的稳定中间过程
Drop Delay需要保证的是：稳定可持续，并且目标液滴不会被过早或过晚的加电而导致分选错误。
如果Drop1或Gap的值发生变动，则需要重新调整Drop Delay。
根据BD Biosciences提供的信息，BD FACS™ Accudrop技术帮助用户确定最佳的Drop Delay值，这个值肉眼是看不见的。软件自动化简化了Drop Delay的确定过程。一旦计算出Drop Delay，系统就会自动调整以维持一个恒定的断裂点，即Sweet Spot。因此，调节Sweet Spot实际上是在优化Drop Delay的过程。通过软件自动化，确保了液滴的稳定性和分选的精确性。这两个过程虽然可以分开讨论，但在实际操作中是紧密相连的，共同确保了流式细胞仪的高效运行和准确分选。
补偿是在分析水平通过数学方法纠正光信号叠加的过程
简单而言，以575nm的带通filter为例，由于spectrum重叠的原因，如果以PE标记，则如何计算进入575nm通道的光，有多少来自FITC，有多少来自PE？该过程即为补偿。
所谓“补偿系数”，指从目标荧光器中减去定比例的来自非目标荧光器的溢出荧光，分母是所测定的非目标荧光器荧光量。
应当注意的是，荧光溢出的原因是荧光染料本身的发射光谱性质决定的，因此，补偿这个行为也是内在的，与选择的抗原表达强度、亮度并没有关系，也不存在补偿会产生错误一说。补偿的根本目的是为了放大离散程度。
调节电压实际是调节PMT的放大倍数
光电倍增管（PMT）确实可以看作是一个中转器，它将光信号转换为电信号，并且具有一定的放大作用。电压的调节会影响PMT的放大倍数，电压越高，放大倍数也越大，从而使得细胞通过时产生的荧光信号差异更加明显。这样，即使是微弱的光信号，也能被有效地转换成较强的电信号，以便于检测和分析。调节电压的本质目的是为了“放大差异以使得可以区分”，类似于数学中矩估计法的思想。
死细胞产生的光子是处于连续波长范围的非选择性荧光来源
死细胞在经过流体动力学聚焦，通过激光束时，同样会随机产生非特异性的荧光，从亮度上看甚至超过了活细胞背景或者部分荧光素。但这种荧光并没有选择性，并不局限与某一特定的波长范围，而是处于连续光谱中，反映到光电系统中就是几乎所有的荧光通道都能接受到这种荧光，并且基本处于同一等级，最关键的是呈由低到高的连续性分布。在散点图上表现为连续的对角线区域分布。而同样可能处于对角线区域的双阳性细胞的特点则是离散性分布的细胞群体，这一点与死细胞明显不同。
DropDelay和AutoDelay是一样的吗？
AutoDelay过程是指自动调整偏转液滴的时间，以确保它们准确地落入收集管中。这个过程通常涉及到打开光学滤波器，以便系统可以检测到通过流动室的荧光标记细胞，并据此调整液滴的偏转。DropDelay是指从喷嘴到分选区域的时间，也就是液滴形成和断裂的时间。而AutoDelay过程中的Delay可能是指在实际分选过程中，系统自动调整液滴偏转时间的一个参数，以确保液滴能够准确地打在收集管中。
尽管这两个术语听起来相似，但它们在流式细胞仪的操作中扮演着不同的角色。DropDelay主要关注的是液滴的形成和断裂，而AutoDelay过程中的Delay则关注的是液滴的偏转和收集。这两个过程虽然是相关的，但它们各自独立地确保了分选过程的准确性和效率。
分选前调整机器的一般过程
- 登录系统，首先调节液流形成（Sweet Spot）以优化Drop Delay，Freq的值一般是固定的，只与喷嘴的直径相关，通过调节Ampl的值使得Drop1和Gap的值与期望值互相接近，断裂点以上大概2-4个液滴并形成稳定状态时，即可认为达到了SweetDrop，点击锁定。
- 使用BD提供的AccuDrop微粒（也就是所谓的DROP）来校准仪器的偏转电场对带电液滴的影响程度。这些微粒是6μm大小的单一群体，每个微粒都包含一个荧光团，能在670nm处激发，在750nm处发射光。因为DropDelay已经被精确确定，因而每一个带电液滴的运行时间和受电场偏转的时间也可以被精确控制，该过程即为调整AutoDelay。调整后(🔴voltage, 🔴optical filter)，可以使得分选液路的目标液滴群体占比达到95%甚至更高，此时即认为液路系统稳定可用。
- 使用test接收管来调整分选液路的精确落下位置。此时可以使用p/s来进行这一过程（🔴voltage, 🔴test sort, 🔴waste drawer）。为什么用p/s？因为p/s的荧光事件数量几乎为0，调整过程中如果需要打开液流室观察落点位置，不会因为机器外盖打开无法激活激光开关而导致分选液路消失，或sort图标不可点击。待观察到分选液路的精确落点在接收管的液面正中时，即可开始分选。如果有阴性对照管，也可以使用阴性对照管完成这一过程。
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