质粒及质粒图谱扫盲
质粒及质粒图谱扫盲独立复制是最关键的性质。
1952 年美国生物学家 Joshua Lederberg 创造 “质粒(Plasmid)”一词，指的是任何染色体外的遗传决定物质，共价、闭合、环状双链DNA（cccDNA），大小从 1kb~1000kb。质粒是一种独立于染色体外独立复制的双链DNA 片段，通常都含有基因。
天然存在的野生型质粒分子量大(＞15kb)、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求。因此，天然质粒必须经过改造才能成为科研工作者的工具：
- 减：把多余的和功能研究无关的片段删除掉，15kb→1~5kb;
- 增：插入多种酶切位点以及遗传标记基因，例如抗性基因（卡那霉素、氨苄霉素…）、报告基因（luciferase、GFP…）等。
质粒的命名
如 pUC19、pCMV、pEGFP-N3。小写字母 p 代表质粒”plasmid”，2~4个大写字母代表发明者、实验室名称或者其他表型性状（CMV 是启动子，EGFP是增强型绿色荧光蛋白）。
质粒的性质
高拷贝数 / 低拷贝数 拷贝数是指每个细菌 / 细胞内质粒的个数，决定了最终所能获得质粒的量。
复制子是质粒复制的关键元件，包括复制起点（ORI）及其调控元件。ORI是DNA复制的起始位点，其序列通常富含A-T碱基对，易于解链，为复制机器提供结合空间。质粒的复制子决定了质粒的拷贝数。质粒的拷贝数与正调控与负调控的相对强度相关，也可通过对复制子进行突变而改变。例如，pMB1的复制子能达到的拷贝数为 15-20。pMB1 的复制子经过改造，得到的 pUC质粒拷贝数能够达到 500-700。
确实，低拷贝数的质粒用途不是十分广阔，主要用于以下两点：
- 扩增大片段或者在高拷贝数质粒扩增时具有致死的基因克隆。
- 质粒的扩增会占用大量资源，当载体用于表达或者其他用途时，也会使用上低拷贝质粒。
严谨型复制 / 松弛型复制
前面介绍到复制子决定了质粒的拷贝数，调节 pMB1 质粒复制子的是一种 RNA分子，通常具有比较高的拷贝数，其复制的时候不需要自身合成蛋白，并且完全依赖宿主细菌或细胞提供的蛋白质，这一类就是松弛型复制，即使宿主挨饿受冻，它依然不停复制。
与之对立的是严谨型复制，像 pSC101 这一类的质粒需要自身合成 RepA蛋白，一旦细胞蛋白质合成受阻，拷贝数就不能增加。
质粒的不相容性
“利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向自细胞的分配过程中彼此竞争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处，这种现象称为不相容性”。通俗地讲，就是“质粒的排他性”——一山难容二虎。如果有两个相同复制子的质粒 A 和 B，A 比较大，复制时间长；而 B序列少，复制时间短，那么在多次扩增之后，B 就会占绝对优势。
那么，是不是复制子相同且大小一致的两个质粒就能共存了？
不一定，即使 A 和 B相同的复制子，相同的大小，也不一定是一致的。相信大家看到过如下的等式（只要某一质粒优势建立起来，经过多代培养，另一质粒就越来越少）：
压力选择
构建的质粒中一般带有某种抗性基因，比如卡那、氨苄。通常我们在培养转化质粒的细胞时，会加入一定浓度的抗生素，一方面是为了抑制其它杂菌的增殖，另外一方面还可以提高细菌中质粒的浓度。
根据质粒载体的用途，大致分为：
- 克隆载体：能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体，这类载体没有启动子等启动转录、翻译的元件。
- 表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori, Ampr, MCS 等）还具有转录 / 翻译所必需的 DNA 序列。
- 干扰基因表达载体：用于减少某个内源基因的表达，该载体上含有针对目标基因 mRNA 的 shRNA，起到基因沉默的作用，下调基因的蛋白表达。
- 病毒质粒：基于病毒的基因组改造而成的质粒，可以独立包装成为病毒颗粒，巧妙地去除了病毒的感染致病性却保留了病毒的其他功能，为功能基因的灵活进入细胞并整合到基因组中提供了非常方便的工具。
如何读懂一个质粒：
- 首先看复制起点 Ori. 了解质粒是原核质粒 / 真核质粒 / 穿梭质粒。原核生物复制起始点只有一个，真核生物 DNA复制起始点有多个。上图中 pEGFP-N2是一个穿梭质粒，穿梭质粒是指可以在多种宿主下复制。
- 看抗性。有很多抗性基因，会在后边加上r，抗性便于后期筛选，比如氨苄 (Amp)，四环素(Tet) 等。上图中抗性为Neor/kanr 两个抗性, Neor 是真核抗性，Kanr 是原核抗性，所以 pEGFP-N2 可以在大肠杆菌和酵母真菌中用不同的抗性药物筛选。看清楚抗性，才能不用错，否则是长不出克隆的。
- Ampr 表达β－内酰胺酶，水解β－内酰胺，解除氨苄的毒性；tetr合成出的蛋白质会阻碍四环素生效；neor（kanr）表达氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活。
- 看多克隆酶切位点MCS。我们目的片段就是要插入这些多克隆酶切位点中间。它具有多种限制内切酶的单一切点（质粒上只能有该内切酶的唯一酶切序列，不然质粒被切成多段了），便于咱们要研究的基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选，最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。
- 看是否含有表达系统原件，即启动子（promoter）－核糖体结合位点（RBS）－转录终止信号（AATAAA) 同时是 polyA）。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。常见的启动子有：CMV、EF1（这俩是启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），35S、2×35S（植物）。
- 看报告基因：例如β- 半乳糖苷酶、EGFP、luciferase等，便于迅速检查功能基因是否表达的阳性判断，表达成功的蛋白在小鼠体内分布位置，直接看EGFP、luciferase 的荧光就 ok。
- 看引物结合区（primer）：一般位于多克隆位点区的上、下游，便于通用引物的PCR 验证、测序验证之用。
注：大多数质粒图谱中都会有箭头，箭头的方向有两种解释：一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。另一种是转录方向，转录方向主要是由启动子开始的一个箭头，是启动子序列的顺序。其中最重要的就是要弄清楚目启动子的方向。
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